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金线莲组培快繁技术研究

放大字体  缩小字体 发布日期:2016-08-03  浏览次数:2813

苗木知识导读: 金线莲Anoectochilus roxburghii(wall.)lindl为兰科开唇兰属多年生草本,别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等,是我国传统珍贵药
西北苗木网2016-08-03日信息:    金线莲Anoectochilus roxburghii(wall.)lindl为兰科开唇兰属多年生草本,别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等,是我国传统珍贵药材,素有“金草”“神药”“乌人参”等美称,在民间应用范围较广,广泛应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面,在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材,特别在台湾省更是备受青睐,被称为“药中之王”[1,2]。


    金线莲种子微小,由未成熟的胚及数层种皮细胞构成,自然萌发率和养殖率低,目前市场上货源主要来自于野生采挖,产品一直处于供不应求的状况。近年来,随着对其药效学和临床应用研究的深入,对金线莲药用价值的认识进一步提高,其市场货源紧缺的状况更为严峻,野生资源也不断遭到破坏性采挖,以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术,解决金线莲种苗来源,加快人工栽培,以保护金线莲野生资源、稳定市场供应。现将有关实验结果如下。
    1、材料与方法
    1.1  材料。无菌养殖体系的建立为浙江金线莲野生种源,其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段。
    1.2 无菌养殖体系的建立。取生长健壮、无病虫害的植株,去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3~5 min,然后用流水冲洗30 min。在超静工作台前,用75% 酒精湿润5~6 s,放入0.1%的HgCl溶液灭菌12~13 min,用无菌水冲洗5~6次。将消毒好的茎按上段(具茎尖)、中段和下段(匍匐茎段)切成长约1.5~2 cm,带有1~2个节间的小段,分别接种于MS+6-BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 培养基上,pH5.6,蔗糖2.5%,琼脂0.7%。培养条件为:温度(25±2)℃ ,光照时间12 h/d,光照强度1 500~2 000 lx。
    1.3  不定芽诱导
    1.3.1  基本培养基对不定芽诱导的影响 采用单因素实验,培养基选用MS(Murashige-Skoog)[3],1/2MS(大量元素减半,其他成分不变),VW(Vacin & Went),B5(Gamborg•Miller & Ojima)和KC(Knudson C)等5种,分别添加6-BA 4.0mg/L,NAA 1.0 mg/L。
   1.3.2  激素对不定芽诱导的影响 以MS为基本培养基,添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素。
    上述实验选取无菌健壮植株,切取长约1~1.5 cm,带有一个节间的茎中段,每处理接10个茎节,重复3次。培养期间定时观察不定芽生长情况,培养60 d后统计不定芽数。其它条件同实验“1.2”项。
   1.4  壮苗培养
    1.4.1  激素对幼苗生长和发根的影响 以1/2MS为基本培养基,NAA设1~5 mg/L 5个处理,6-BA设0.5,1.0和1.5 mg/L 3个处理,共15个处理。
    1.4.2  添加物对幼苗生长和发根的影响以1/2MS+NAA 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L为基本培养,考察马铃薯提取物、香蕉提取物、苹果提取物、椰子汁等4种天然有机物和活性炭对金线莲幼苗生长的影响。
    上述每种培养基均接入经增殖培养高约3 cm,具3~4节间、有1~2片的无根幼苗,每处理接种接无根幼苗10株,重复3次。培养后每隔15 d观察生长情况1次,至3个月考察每株净增加的叶片数、重量及发根数,并进行数理统计分析。
    1.5  移栽  选苗高约6~8 cm,茎基直径约2 mm,丛生根有2~3条的试管苗,炼苗4 d后,洗净附着在植株上的培养基,并晾干洗涤水后移人直径为15 cm,装有不同基质的土盆中,考察不同基质对金线莲试管苗成活率的影响。移栽前,实验基质均用45%多菌灵可湿性粉剂800倍溶液浇透消毒。实验条件为遮荫度80%的荫棚,保持空气相对湿度的80%~90%。如发现有病死植株,及时拔除。每处理5盆,每盆种5株,重复3次,移栽3个月后考察成活株数,并进行数理统计分析。
    2、结果
    2.1 无菌养殖体系的建立  实验表明,外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。从表1可知,上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在,顶端优势表现较为强烈,因而以生长为主,不定芽发生较少,平均芽增殖数为0.6个;中段茎不定芽发生快、量大、长势好,平均芽增殖数为4.05个,并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化,虽有不定芽发生,但发生量与生长势均较弱。这和陈自力[4]报道的结果一致。
    从实验中观察到,不定芽的产生以侧芽萌生为主。一般在培养15~20 d后,茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大,芽丛在节的四周萌出,起初为白色略带黄色,随着培养时间加长,芽不断伸展,逐渐转为黄绿色,形成主芽。叶腋芽是单生的,极个别节上能对生两个腋芽,未发现茎部或切口处长出不定芽。培养30 d左右,主芽基部的节再生侧芽(称一级侧芽),45 d左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽,随着芽的生长、出现叶片,节处毛并产生根,外被浓密的白色绒毛,从而形成完整小植株。培养3个月后每天观察,侧芽分生组织的增殖,一般只出现主芽和一二级侧芽或苗;培养5个月以上,主芽、侧芽较高,叶片较多、大,只有少数出现三级侧芽或苗。这种腋芽萌生的增殖形成了主轴分枝型的芽苗,随培养时间或继代养殖代数的增加,或激素的作用,芽或苗因节间短,多数为形成似不定芽或丛生苗。培养过程中,未见愈伤组织,也没有发现有原球茎和类原球茎产生。
    表1  金线莲茎段外植体不定芽诱导(略)
    2.2  不定芽诱导
    2.2.1  基本培养基对不定芽诱导的影响 以金线莲的茎节段作为外植体,腋芽能快速萌发出不定芽体。经60 d的培养,增殖倍数可达3.1~5.4倍。但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响,MS,B5培养基不定芽增殖率分别为5.4倍与5.2倍,比其它培养基增加23.8%~74.2%。
    表2  基本培养基对金线莲不定芽诱导的影响(略)
    经LSR差异显著性测定,MS,B5培养基之间无明显差异,与1/2MS,KC和VW之间存在极显著差异,且MS,B5培养基上诱导产生的不定芽色绿、粗壮(见表2),表明MS,B5培养基适合作为金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基[5]。
2.2.2  激素对不定芽诱导的影响  激素种类、水平与配比对组织培养快速养殖在效率存在明显的影响,6-BA、KT和NAA是3种常用生长调节剂,其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大。结果见表3。从表3可知,同为细胞分裂素的6-BA,KT在相同的添加量下对不定芽的增殖效果差异极显著,6-BA比KT的增殖率提高46.0%和55.0%,表明6-BA比KT更适合金线莲茎节不定芽的诱导。
    6-BA的浓度也影响不定芽诱导效果。在添加量小于4.0 mg/L的情况下,随浓度的提高,不定芽增殖率明显上升,添加量为4.0 mg/L的不定芽增殖率比2.0,1.0 mg/L分别提高22.1%和47.6%。当6-BA添加量达到6.0 mg/L时,其增殖率还出现下降趋势,表明本实验条件下6-BA添加的适宜量为4.0 mg/L。
    表3  激素对金线莲不定芽诱导的影响(略)
    生长素NAA对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进作用。从表3可以看出,添加了NAA的培养基不定芽增殖量与生长明显较不添加的好,芽体粗壮、色浓绿,其中添加0.5 mg/L的表现最好,添加1.0 mg/L的其次,但二者间差异未达到显著水平;与其它不添加NAA的相比差异达极显著水平。表明在本试验条件下NAA适宜添加的量为0.5~1.0 mg/L。
    2.3  壮苗培养
    2.3.1  激素对幼苗生长的影响  在金线莲壮苗培养中,NAA较6-BA对促进幼苗生长的影响更为明显。结果见表4。NAA浓度低于3 mg/L时,对幼苗生长有促进作用,随浓度的增加,叶片净增量、发根数和鲜重净增量明显增加,当浓度达到4.0 mg/L时,叶片净增量、发根数和鲜重净增量增加不明显。6-BA在0.5 mg/L情况下,比不加的具有一定的促进作用,但未达显著水平;在浓度为1.0 mg/L,1.5 mg/L情况下,叶片净增量、发根数和鲜重净增量反而减少,但在幼苗基部观察到丛生状不定芽的产生,表明6-BA在浓度高于1.0 mg/L情况下,有利于金线莲不定芽的生成,对幼苗生长不利。
    从表4也可以看出,处理9、10号在发根数、鲜生净增量方面较其它处理明显提高,达极显著差异;在叶片净增量方面,除与处理13、14号无明显差异外,与其它处理之间的差异达极显著水平,表明在金线莲壮苗培养中,NAA适宜添加的量为3.0~4.0 mg/L,6-BA 添加量为0.5 mg/L或不加。
    表4  激素对金线莲幼苗生长的影响(略)
    2.3.2  活性炭与有机添加物对幼生长的影响  结果见表5。从表5可知,不同的添加物对金线莲幼苗生长的影响表现不一,香蕉、椰子汁对促进幼苗生长最为有利,叶片净增量、发根数和鲜重净增量均高于其它处理,二者间无明显差异;马铃薯对幼苗生长不利,与其它处理相比均存在极显著差异水平。活性炭对金线莲幼苗生长具有一定的促进作用,在添加0.3%情况下,叶片净增量、发根数和鲜重净增量与对照相比均显著提高,差异达极显著水平;但与香蕉、椰子汁处理相比,其促进幼苗生长的作用不如前二者,除发根数无差异外,叶净增量与香蕉、椰子汁处理差异达显著水平,鲜重净增量差异达极显著水平。同时观察到活性炭、香蕉和椰子汁新发根洁白、粗壮。试验结果表明添加20%香蕉和椰子汁最适宜金线莲幼苗的生长。 
    2.4  移栽  金线莲试管苗移栽3个月后的植株成活情况见表6。从表6中可以看出,处理7和处理9保持100%的成活率,处理3和处理8的植株成活率也在93%以上,处理1的成活率最低,仅为56%。经LSR差异显著性测定,处理3、7、8、9号之间无明显差异,与处理5、6号差异达显著水平、与处理1、2、4号差异达极显著水平。表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活率,适宜添加的比例为1份菜园土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份,要求充分混匀。
    表6  种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响(略)
    3、小结
    金线莲不同部位的茎间对不定芽的诱导结果存在明显的差异,以不含顶芽和长根的中间段茎节为好,不定芽增殖率达4倍以上。
    采用金线莲中间茎节作外植体诱导不定芽萌发时,适宜的培养基为MS或B5+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L~1.0 mg/L,蔗糖浓度为2.5%。
    适宜的壮苗培养基为1/2MS+NAA 3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+香蕉提取物20%(或椰子汁20%),蔗糖浓度为3.0%。3.4试管苗在充分混匀的1份菜园土+2份粗砂(2~3 mm)+1份木屑,或1份菜园土+粗砂1份+木屑2份的基质中生长良好,3个月后成活率达100%。
 
 
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